Imagej Gleitender Durchschnitt

AF-Mikroanpassungstipps von John Reilly (Neuroanatomist) Autofokus-Mikroeinstellung (AFMA) ist ein Verfahren, das es einem Benutzer ermöglicht, kleine Fehler der Front - oder Rückfokussierung zu korrigieren. Es ist ein Merkmal, das nur bei bestimmten Modellen von Canon dSLRs vorhanden ist (derzeit 50D, 7D, 5D Mark II, 1D Mark III, 1D Mark IV, 1Ds Mark III und 1D X). AFMA wird den größten Nutzen für Linsen mit schnellen Blenden (f2.8 und breiter) haben, denn die dünne Schärfentiefe bei breiten Blenden macht auch kleine Fokusfehler deutlicher. Dieser Tipp besteht aus zwei Hauptabschnitten, einer praktischen Zusammenfassung des Verfahrens für diejenigen, die direkt eintauchen möchten, gefolgt von mehr technischen Diskussionen, darunter einige DIY-Optionen für ein Test-Setup. Der einfachste Weg, eine AFMA durchzuführen, ist mit einem kommerziellen Werkzeug wie dem LensAlign MkII oder dem DataColor SpyderLensCal (siehe unten zur Erläuterung der häufigen Fehler der druckbaren Testdiagramme und Moirmuster und einer vernünftigen Workaround). Richten Sie das Werkzeug auf einen Tisch oder idealerweise ein kleines Stativ und stellen Sie Ihre Kamera auf ein stabiles Stativ. Der Abstand zwischen dem Kalibrierwerkzeug und der Kamera sollte etwa das 25-fache der Brennweite des Objektivs betragen (z. B. 85mm x 25 2,1 m 7 Fuß), obwohl irgendwo innerhalb der 5-50x Brennweite funktionieren wird. Beachten Sie, dass der Abstand von 25x Brennweite unabhängig von der Sensorgröße 7 Fuß für ein 85mm Objektiv auf APS-C, APS-H oder FF geeignet ist. Wenn Sie ein Zoomobjektiv einstellen, stellen Sie den Abstand auf die längste Brennweite ein und führen Sie die Kalibrierung bei dieser längsten Brennweite durch (beachten Sie, dass mit dem neuen 1D X ein Zoomobjektiv mit zwei separaten Einstellwerten für die lange und kalibrierung kalibriert werden kann Breite Enden). Für lange Linsen brauchst du viel Platz. Richten Sie die Kamera so aus, dass das mittlere AF-Messfeld auf das Fokusziel zentriert ist, und richten Sie die Kamera so aus, dass die Sensorebene parallel zum Fokusziel ist (mit den Sichttoren im LensAlign oder durch Sicherstellen, dass beide für das SpyderLensCal sind). Die Beleuchtung ist wichtig - idealerweise eine helle, konstante Beleuchtung sowohl für das Fokusziel als auch für das Lineal, wobei die Beleuchtung für die letztere abgewinkelt ist, um Reflexion zu vermeiden. Ich schlage vor, mit einem Paar Schreibtisch Lampen, eine Beleuchtung der Lineal aus hohen Winkel, die andere Beleuchtung der Fokus Ziel. Ich benutze eigentlich drei Lampen, je 150 W-Äquivalent. Heres, was mein typisches Setup aussieht: Wenn bequem, eingerichtet, um zu schießen gebunden (youll müssen Bilder bei 100 zu überprüfen). Setzen Sie die Kamera im Av-Modus, maximale Blende, und zu diesem Zweck ist es am besten, in JPG mit dem Picture Style auf Monochrom zu schießen (wenn Sie in Farbe mit einem Objektiv wie die 50L oder 85L schießen, bereit sein, eine Menge von Längsrichtung zu sehen CA). Verwenden Sie eine Remote-Freigabe oder Selbstauslöser und die Spiegelverriegelungsfunktion. Zugriff auf die Einstellung C. Fn für die AF-Mikroeinstellung (im Bereich AutofocusDrive) und wählen Sie 2: Anpassen durch Objektiv. An diesem Punkt gibt es mehrere Möglichkeiten, um Ihre Testaufnahmen zu nehmen. Sie können iterativ Klammer schießen bei -20, -10, 0, 10 und 20 und sehen, welche Paar von Einstellungen Klammer korrekten Fokus auf den Nullpunkt des Lineals, dann schmal es weiter. Oder Sie können bei jeder Einstellung von -20 bis 20 schießen. Der wichtige Punkt ist, mehrere Aufnahmen bei jeder AFMA-Einstellung zu machen, nicht nur ein oder zwei besonders in der Region, in der Ihre Anpassung endet, und um wenigstens einige Aufnahmen zu starten Aus dem Unendlichkeitsfokus und einigen, beginnend mit dem minimalen Fokusabstand (MFD). Heres meine Strategie: Nehmen Sie einen Schuss auf Null und überprüfen Sie für Front-oder Back-Fokus (z. B. wenn die Brennebene ist vor dem Nullpunkt auf dem Lineal, das ist Front-Fokus). Frontfokus erfordert positive Anpassung an Korrektur, Rückenfokus erfordert negative Einstellung. Ich schieße Einzelaufnahmen ab Unendlichkeitsfokus und Rezension bei maximalem Zoom auf der hinteren LCD, in Schritten von 5 Einheiten dann verengen weiter, bis ich eine vorläufige AFMA-Einstellung für das Objektiv habe. Dann schieße ich auf insgesamt 11 AFMA-Einstellungen 5 Einheiten auf beiden Seiten meiner vorläufigen Wahl. Bei jeder Einstellung schieße ich acht Schüsse, zwei aus der Unendlichkeit, dann zwei ohne Refokussierung, dann zwei aus der MFD, dann zwei weitere ohne Refokussierung. Ich übertrage dann die Bilder auf meinen Computer und überprüfe sie bei 100. DPP zeigt die AFMA-Einstellung als Teil der EXIF-Daten an (oder du kannst eine Post-it-Note mit der aktuellen Einstellung auf das Ziel setzen). Ignoriere irgendwelche offensichtlich unscharfe Aufnahmen, wo kein Teil des Lineals klar ist. Finde ich in der Regel, dass ich, wenn ich durch die Bilder gehe, bei der Annäherung an die beste Anpassung die Schüsse aus der Unendlichkeit ausgeschaltet sein wird, dann bei der besten Anpassung, die alle auf der Stelle sind, dann, wenn ich wegziehe, werden die Aufnahmen von der MFD ausgeschaltet, oder umgekehrt. Für mich dauert der ganze Prozess ca. 30 Minuten pro Objektivkombination. Ich finde oft, dass 3-4 Anpassungswerte ok aussehen (z. B. 1 bis 3, also verbrachte ich nur den Durchschnitt), ein breiteres Blendenobjektiv mit dünnerem DoF gibt eine engere Reichweite. Einige andere wichtige Leckerbissen: Die Kamera speichert bis zu 20 Objektiv-spezifische Anpassungen Anpassungen sind durch Objektivtyp, also, wenn Sie mehr als eine Kopie eines Objektivs haben, kann die Kamera nicht auseinander sagen (obwohl die 1D X kann sie auseinander basieren Auf Objektiv-Seriennummer) ein Objektiv plus Extender zählt als zusätzliches Objektiv (und muss separat von der blanken Linse kalibriert werden). Das ist die kurze Version für mehr Details und Theorie, oder wenn Sie es vorziehen, überspringen Sie das Ende für einen DIY Vorschlag, um ein kommerzielles Kalibrierungswerkzeug zu ersetzen. Warum ist die AF-Mikroeinstellung wichtig Kameras und Linsen werden auf Fließbändern gefertigt, und Toleranzen gelten für jeden Herstellungsprozess eine gewünschte Spezifikation und eine Reihe von akzeptablen Werten um diese. Wenn du Glück hast, bekommst du eine Kamera und ein Objektiv, die beide auf der Stelle sind oder von der gleichen Menge in die gleiche Richtung sind, und das Leben ist gut. Wenn Sie mehrere Linsen und Körper haben, sind die Chancen ein oder mehrere benötigen einige Anpassung. Der andere Faktor ist Schärfentiefe (DoF) je breiter die Blende, desto flacher die DoF. Mit relativ schmaleren Öffnungen, wie z. B. dem F3.5-5.6-Bereich, der üblicherweise auf Consumer-Zoom-Objektiven gefunden wird, ist der DoF tief genug, um kleinere Fokusfehler zu maskieren, so dass AFMA in diesen Fällen nicht so wichtig ist. Aber mit schnellen Objektiven, die flachen DoF erreichen, sind auch kleine Fokusfehler sehr deutlich. Vor der Verfügbarkeit von AFMA, die einzige Option, um diese Probleme zu korrigieren war, Kamera (n) und Objektiv (es) in Canon zu senden und Sie mussten Ihr komplettes Kit an sie senden. Die Notwendigkeit von Pro-Fotografen zu haben, dass getan wurde ein Teil der Grund Canon startete Canon Professional Services. Was ist die AF-Mikroeinstellung AFMA korrigiert die Vorspannung im AF-System, oder anders ausgedrückt verbessert es die globale Genauigkeit des AF-Systems. Die Begriffe Genauigkeit und Präzision werden manchmal (unsachgemäß) austauschbar verwendet - Genauigkeit ist die Nähe zu wahr, während Präzision Wiederholbarkeit ist. Heres ein schematisches Beispiel: AFMA korrigiert für Genauigkeit, aber nichts für Präzision. In Wirklichkeit bewegt es den Mittelpunkt - die mittlere Brennebene mehrerer Messungen. Aber es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Präzision eine Rolle spielt, also, wenn Sie Ihr AF-System mit nur einem oder ein paar Versuchen testen, zufällige Chance sagt, dass Ihr Test nicht vor Ort wegen Ungenauigkeit sein wird. Wenn Sie also die AF-Leistung testen, müssen Sie mehrere Tests für ein gegebenes Objektiv durchführen, und es werden weniger Tests für ein f2.8 oder ein schnelleres Objektiv benötigt, da das Präzisions-AF-Messfeld durch ein solches Objektiv aktiviert wurde. Ich vermute, das ist was ist hinter Canons Aussage, dass AFMA kann verhindern, dass richtige Fokussierung - wenn Sie eine Anpassung auf ein oder zwei Testaufnahmen Basis, und diese Aufnahmen waren relativ weit weg von der richtigen Brennebene, dann im Durchschnitt die meisten Ihrer nachfolgenden Aufnahmen wird Fokus fehlen . Es ist bemerkenswert, dass, obwohl wir testen und setzen AFMA auf der Tiefe des Feldes, was tatsächlich betroffen ist Tiefe des Fokus. Das macht Sinn, denn das AF-System kann nicht kontrollieren, was vor dem Objektiv ist, sondern kann kontrollieren, was hinter dem Objektiv los ist. Die Tiefe des Fokus bezieht sich auf den Bereich des kritischen Fokus, der den Sensor umgibt, und dieser Bereich ist ein Bruchteil von einem Millimeter dick. Canon spezifiziert die Präzision des AF-Systems innerhalb einer Tiefe des Fokus für eine maximale Objektivlinse für Standard-Präzisions-AF-Messfelder und innerhalb von 13 der Tiefenschärfe für eine maximale Objektivlinse für hochpräzise AF-Messfelder, die durch aktiviert werden Schnellere Linsen (f2.8 Mittelpunkt auf den meisten Körpern, f4 Mittelpunkt auf 1-Serie Körper). Eine Einheit von AFMA entspricht 18 der Tiefenschärfe einer gegebenen maximalen Blende des Objektivs. Keine Kamera wird jedes Mal in jeder Entfernung ein perfekt fokussiertes Bild erzeugen, und kein Einstellvorgang wird das ändern. Was eine richtige AFMA tun kann, erhöht den Prozentsatz der Schüsse, die korrekt fokussiert sind. Gibt es einen noch besseren Weg Wenn das Verfahren wie eine Menge Arbeit scheint, ist es ja, dort sind fast sicher bessere Wege. In einem Beitrag auf dem Canon-Rumors-Forum beschrieb der Benutzer epsiloneri eine Methode zur Analyse des Kontrasts eines Fokusziels (Standardabweichung von Pixelintensitäten) und Plotten der Daten mit einer parabolischen Kurve, um die beste AFMA-Einstellung zu bestimmen. Dies sieht aus wie eine sehr genaue Methode, obwohl wahrscheinlich viel zu mühsam ohne eine Möglichkeit, die Analyse zu automatisieren (z. B. MATLAB oder ImageJ). In der Theorie sollte es möglich sein, einen genauen Fokus mit der Kontrasterkennung in der Live-Ansicht zu erzielen, wo keine Ausrichtung erforderlich ist, da der Bildsensor verwendet wird, um den besten Fokus zu bestimmen, dann das mit der Phasendetektion AF zu vergleichen und entsprechend zu korrigieren. In der Praxis ist das etwas, das schwer zu tun ist (weil der Akt, den Fokusring zu bewegen, um zu sehen, ob du wirklich optimal konzentriert bist, den Fokus ändert und du den Nullpunkt verlierst). Allerdings ist dies eine Idee, die Canon als eine halbautomatisierte Routine implementieren könnte, dh das Ziel einzurichten und auszurichten (Canon könnte es verkaufen und es passend überladen, wie es für andere kleine Stücke von Plastikhusten ist), dann die Kamera automatisch Bestimmt die optimale Einstellung. Datei, dass man unter gee, wäre es nicht schön Wenn es richtig gemacht wird, wird es perfekt sein Nein, das AF-System wird nie perfekt sein. Es gibt ein paar große Gründe dafür. Die erste ist, dass jedes System leidet aus Zufälligkeit alle eine genaue AFMA tut maximiert die Häufigkeit der Fokus-Aufnahmen Sie bekommen, aber es wird noch einige Misses. Der andere Grund ist, dass das Fokusziel eine ideale Situation flach mit hohem Kontrast ist. Die Welt besteht nicht aus Fokuszielen - wenn es war, wäre die Fotografie ziemlich langweilig. Die Komplexität der realen Welt Szenen wird durch unsere Erwartungen weiter verstärkt. Sie zielen auf Ihre Kamera und platzieren Sie das AF-Messfeld sorgfältig auf die Funktion Ihres Motivs, auf das Sie sich konzentrieren möchten. Allerdings kann das AF-System nicht lesen Sie Ihren Geist alles, was es tun kann, ist auf die Region der höchsten Phasendifferenz im Bereich des AF-Messfeldes zu sperren. Beachten Sie, dass das aktuelle AF-Messfeld größer ist als das kleine Feld, das den Punkt im Sucher darstellt. Auch bei der Spot-AF-Funktion bei bestimmten Kameras (7D, 1D Mark IV und 1D X), die die effektive Größe des AF-Messfeldes reduziert, ist der tatsächliche empfindliche Bereich gleich oder etwas größer als die Darstellung im Sucher. Bei bestimmten Fächern, insbesondere bei spitzen Winkeln zur Kamera mit einem dünnen DoF, kann sich das AF-Messfeld auf eine von zwei verschiedenen Merkmalen verteilen, die spürbar unterschiedliche Fokalebenen ergeben. Beide würden für das AF-System korrekt sein. Kostenlose Testmethoden, die mit ihnen falsch sind Es gibt ein paar Ansätze zur Durchführung von AFMA ohne eines der kommerziellen Werkzeuge. Man beinhaltet das Einrichten eines Moir-induzierenden Musters auf einem Computermonitor und die Bewertung des Fokus basierend auf Live View auf dem hinteren LCD der Kameras. Das ist eine ziemlich einfache Methode, aber es hat zwei Probleme. Zuerst ist es schwierig, das Setup auszurichten, so dass der Sensor parallel zum LCD-Bildschirm ist. Zweitens habe ich festgestellt, dass es eine Menge Ungenauigkeit in der Methode gibt, wenn man ein Moir-Muster bei 10x Live View sieht, kann die Kamera hin und her bewegt werden, ohne eine spürbare Veränderung des Musters auf dem hinteren LCD zu sehen. Der andere freie Ansatz beinhaltet ein Diagramm, das Sie herunterladen und ausdrucken, dann Position an einem 45 Winkel zu Ihrer Kamera, Fokus auf eine dunkle Linie und verwenden Sie die Skalen an den Seiten, um Fokus zu überprüfen. Das Problem dabei ist, dass das Fokusziel (Linie) und die DoF-Skala in der gleichen 45 Ebene liegen, so dass das Ziel nicht orthogonal zum Sensor ist. Eigentlich, was ist wahrscheinlich die beliebteste Version dieses Diagramms hatte eine ältere Version (noch verfügbar), wo Sie gedruckt zwei Seiten, dann schneiden Sie eine wie die alten Tab Ein Slot B Spielzeug ausgeschnitten aus einer Getreide-Box, und klebte auf Die andere Seite. Der Schöpfer hielt diesen Ansatz aufgrund der Variabilität der Montage, die zu variablen Ergebnissen führte. Die aktuelle Version verwendet eine dunkle horizontale Linie als Fokusziel, mit der Begründung, dass, weil die Linie horizontal ist, spielt es keine Rolle für das AF-System, dass die Seite in einem Winkel ist, es zeigt sich immer noch als 2D horizontale Linie. Das ist wahr, aber dann wird es nur möglich, den horizontalen, linienempfindlichen Teil des AF-Messfeldes optimal zu aktivieren. Bei vielen Kameras geht das nicht gut. Der aktuelle xxD und der 7Ds f2.8 Sensor sind ein paar diagonale Linien, was bedeutet, dass eine dünne Schwarz-auf-Weiß-Linie, die horizontal ausgerichtet ist, diesen Sensor nicht aktivieren wird. Für die RebelxxxD-Linie und den 5D5DII ist der f2.8-Sensor ein senkrechter, linienempfindlicher Sensor, der die horizontale Linie auf dem Diagramm ignoriert. So wird diese horizontale Linie nur den f5.6 horizontalen, linienempfindlichen Teil des Cross-Typ-Sensors im mittleren AF-Messfeld aktivieren. Sie können sich fragen - warum hat der Kerl das Diagramm so gemacht, dass ich es erraten würde, weil er es entworfen hat, um AF auf Nikon-Kameras zu testen, die nicht die hochpräzise AF-Punkt-Fähigkeit haben - ihre Cross-Type-Sensoren sind f5.6- Empfindlich in beiden Orientierungen, so dass eine horizontale Linie Ziel sollte gut sein. Der bessere DIY-Ansatz Wenn youd eher nicht ein kommerzielles Werkzeug für AFMA kaufen würde, würde mein Rat sein, die wichtigen Eigenschaften dieser Werkzeuge mit preiswerten Substituten neu zu erstellen. Heres was Id empfehlen Es würde ein Karton, ein Buch, ein Maßband, ein Stäbchen oder Bleistift, und ein Ausdruck dieses Fokus Ziel (dank Bob Williams für den Link) erfordern. Es könnte auf einem Tisch, oder sogar den Boden, wenn nötig eingerichtet werden. Wenn du ein gutes Stativ hast, würdest du das stattdessen die Kamera auf ein Buch legen. Das Fokusziel wird auf die Box geklebt, unten, und der Chopstickpencil wird am Rand der Box stecken, senkrecht auf das Ziel zentriert. Der Stäbchen unterstützt das Maßband schräg. Beachten Sie die Messung auf dem Maßband, wo es neben dem Ziel passiert - das ist Ihr Nullpunkt, gegen den Sie vorne oder hinten fokussieren können (wenn Sie Ihre Bilder bei 100 auf Ihrem Computer überprüfen). Wählen Sie ein Buch mit einer Dicke aus, die das Objektiv auf etwa der gleichen Höhe zentriert wie die Mitte des Fokusziels. Das Setup würde so aussehen: Ich hoffe, das klärt einige der Fallstricke in AF-Systemen und die Vorteile und Verfahren für die Erreichung einer nützlichen AFMA. Happy (und Sharp) ShootingNovember 04, 2010 Die folgenden Informationen sind eine aktualisierte Version einer Methode für die Verwendung von ImageJ, um Western-Blots von einer jetzt veralteten älteren Seite zu analysieren. Wenn Sie nach einer umfangreicheren Workflow-Option für Ihre Western-Blot-Analysen suchen, besuchen Sie bitte mein Tutorial zur Verwendung von Image Studio Lite. Ein kostenloses Softwarepaket von LI-COR Biosciences. Die Image Studio Lite Software kann kostenlos von licorislite heruntergeladen werden. Zusätzlich zu der unten beschriebenen Funktionalität für ImageJ bietet Image Studio Lite zusätzliche Datenverwaltungsfunktionen sowie Annotationswerkzeuge für die Herstellung von Publikationsbereiten Bildern Ihrer Westerns. ImageJ (rsb. info. nih. govijindex. html) kann verwendet werden, um die Dichte (aka Intensität) von Banden auf einem Agar Gel oder Western Blot zu vergleichen. Dieses Tutorial geht davon aus, dass du dein Gel getragen hast oder durch den Visualisierungsschritt blotst, so dass du ein digitales Bild deines Gels in. tif hast. Jpg Png oder andere Bildformate (ein 16-Bit. tif wäre das bevorzugte Format, um die maximale Menge an Informationen im Originalbild zu behalten). Wenn Sie Röntgenfilme auf einem Flachbettscanner scannen, stellen Sie sicher, dass Sie einen Scanner mit der Fähigkeit zum Scannen von Transparentfolien (d. h. Film) verwenden und die Scannersoftware verwenden, um 16-Bit-Tiff-Bilder zu speichern. Sehen Sie sich die Referenzen am Ende dieses Tutorials für eine Diskussion über die verschiedenen Möglichkeiten, dass Sie diesen Schritt nach oben schrauben können. Dies geht auch davon aus, dass Sie Ihr Blotbild nicht überbelastet haben, als Sie es produziert haben. Für eine Erklärung, warum Überbelichtung wird Ihre Ergebnisse ruinieren, siehe diese Seite. Die hier beschriebene Methode verwendet die in der ImageJ-Dokumentation skizzierte Gelanalyse-Methode: Gelanalyse. Sie können es lieber verwenden, anstatt die Methoden, die ich unten skizzieren. Es sollte sehr wenig Unterschied zwischen den Ergebnissen der verschiedenen Methoden. Diese Version des Tutorials wurde mit ImageJ 1.42q auf einer Windows 7 64-Bit-Installation erstellt. 1. Öffnen Sie die Bilddatei mit FilegtOpen in ImageJ. 2. Die Gelanalyse-Routine erfordert, dass das Bild ein Graustufenbild ist. Die einfachste Methode, um in Graustufen umzuwandeln, ist, auf ImagegtTypegt8-Bit zu gehen. Ihr Bild sollte aussehen wie Abbildung 1. Abbildung 1. Ein gefertigtes Western-Blot-Bild wurde in ImageJ geöffnet. Die Information entlang der Oberseite des Bildes zeigt an, dass das Bild derzeit im 8-Bit-Modus ist, wobei eine invertierende LUT (Nachschlagetabelle) verwendet wird. Die invertierende LUT sorgt dafür, dass dunkle Bänder als höhere Dichtewerte aufgezeichnet werden. 3. Wählen Sie aus der ImageJ-Symbolleiste das Werkzeug Rectangular Selections. Zeichne ein Rechteck um die erste Spur. ImageJ geht davon aus, dass Ihre Gassen vertikal verlaufen (so dass einzelne Bänder horizontal sind), also sollte Ihr Rechteck groß und schmal sein, um eine einzelne Spur zu umschließen. Wenn Sie ein kurzes und breites Rechteck zeichnen, wechselt ImageJ auf die Annahme, dass die Bahnen horizontal verlaufen (einzelne Bänder sind vertikal), was zu viel Verwirrung führt. Abbildung 2. Die erste Spur wurde mit dem Rectangular Selection Tool ausgewählt. 4. Nachdem Sie das Rechteck über die erste Spur gezeichnet haben, drücken Sie die Taste 1 (Command 1 on Mac) (Command 1 on Mac) oder gehen Sie zu AnalyzegtGelsgtSelect First Lane, um die Rechteck an Ort und Stelle Die erste Spur wird nun hervorgehoben und hat eine 1 mitten drin. 5. Benutze deine Maus, um in der Mitte des Rechtecks ​​auf der 1. Spur zu klicken und zu halten und es auf die nächste Spur zu ziehen. Sie können auch mit den Pfeiltasten das Rechteck verschieben, obwohl dies langsamer ist. Zentrieren Sie das Rechteck über die Fahrspur von links nach rechts, aber es macht sich keine Sorgen, dass es sich perfekt auf die gleiche vertikale Achse aussetzt. Image-J wird das Rechteck automatisch auf der gleichen vertikalen Achse wie das 1. Rechteck im nächsten Schritt ausrichten. 6. Drücken Sie 2 (Befehl 2 auf Mac) oder gehen Sie zu AnalyzegtGelsgtSelect Next Lane, um das Rechteck über die 2. Spur zu setzen. A 2 erscheint auf der Spur, wenn das Rechteck platziert ist. 7. Wiederholen Sie die Schritte 5 6 für jede nachfolgende Spur auf dem Gel und drücken Sie jeweils 2 (Befehl 2 auf Mac), um das Rechteck einzustellen (Abbildung 3). Abbildung 3. Platzieren Sie das Rechteck über jede Spur und drücken Sie jedes Mal 2, um das Rechteck einzustellen. 8. Nachdem Sie das Rechteck auf die letzte Spur gesetzt haben (durch Drücken von 2), drücken Sie 3 (Befehl 3 auf Mac) oder gehen Sie zu AnalyzegtGelsgtPlot Lanes, um ein Profil-Diagramm von jeder Spur zu zeichnen. Abbildung 4. Das Profil-Plot aus dem Beispiel Western-Blot. 9. Die Profilkurve repräsentiert die relative Dichte des Inhaltes des Rechtecks ​​über jede Spur. Die Rechtecke sind von oben nach unten auf dem Profil-Plot angeordnet. Im Beispiel des Western-Blot-Bildes entsprechen die Peaks im Profil-Diagramm (Abbildung 4) den dunklen Bändern im Originalbild (Abbildung 3). Da es vier Bahnen gab, gibt es vier Abschnitte im Profil. Höhere Peaks stellen dunklere Bands dar. Größere Peaks repräsentieren Bänder, die einen größeren Größenbereich auf dem ursprünglichen Gel abdecken. 10. Bilder von echten Gelen oder Western-Blots haben immer ein Hintergrund-Signal, so dass die Peaks don8217t bis zur Grundlinie des Profil-Plots reichen. Abbildung 5 zeigt einen Peak von einem echten Blot, bei dem es einige Hintergrundrauschen gab, so dass der Peak über der Grundlinie des Profilplots zu schweben scheint. Es wird notwendig sein, den Gipfel zu schließen, damit wir seine Größe messen können. Abbildung 5. Echte Western-Blots haben oft etwas Hintergrundrauschen, so dass der Peak nicht auf die Grundlinie reicht (perfekt weiß). 11. Wählen Sie aus der ImageJ-Symbolleiste das Selektionslinien-Werkzeug aus (Abbildung 6). Für jeden Peak, den du im Profil-Plot analysieren möchtest, zeichne eine Linie über die Basis des Peaks, um den Peak zu umschließen (Abbildung 5). Dieser Schritt erfordert einige subjektive Beurteilung auf Ihrem Teil zu entscheiden, wo die Spitze endet und das Hintergrundgeräusch beginnt. Abbildung 6. Verwenden Sie das geradlinige Werkzeug, um die Basis jedes interessierenden Peaks zu schließen. Fig. 7 Der Peak aus Fig. 5 ist mit einer Linie gezeigt, die über die Basis des Peaks gezogen ist, um den Bereich des Peaks zu umschließen. 12. Beachten Sie, dass, wenn Sie viele Spuren hervorgehoben haben, die späteren Spuren am unteren Rand des Profil-Plot-Fensters versteckt werden. Um diese Bahnen zu sehen, drücken und halten Sie die Leertaste, und verwenden Sie die Maus, um zu klicken und ziehen Sie das Profil-Plot nach oben. 13. Wenn jeder Peak an der Basis mit dem Sekundärlinien-Auswahlwerkzeug geschlossen wurde, wählen Sie das Zauberstab aus der ImageJ-Symbolleiste aus (Abbildung 8). Abbildung 8. Wählen Sie das Zauberstab-Werkzeug, um jede Spitze des Interesses auf dem Profil-Plot hervorzuheben. 14. Mit der Leertaste und der Maus ziehen Sie das Profil-Plot zurück, bis Sie wieder auf der ersten Spur sind. Klicken Sie mit dem Zauberstab in den Gipfel (Abbildung 9). Wiederholen Sie diese für jeden Peak, wie Sie gehen die Profil-Plot. Für jede Spitze, die Sie hervorheben, sollten Messungen im Ergebnisfenster erscheinen, das angezeigt wird. Abbildung 9. Klicken Sie in den ersten Peak von Interesse mit dem Zauberstab. Der Peak sollte hervorgehoben werden und eine Messung sollte im Ergebnisfenster auftauchen. 15. Wenn alle Peaks hervorgehoben wurden, geh zu AnalyzegtGelsgtLabel Peaks. Dies markiert jeden Peak mit seiner Größe, ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtgröße aller hervorgehobenen Peaks. 16. Die Werte aus dem Ergebnisfenster (Abbildung 10) können durch Auswahl von EditgtCopy All im Ergebnisfenster in ein Tabellenkalkulationsprogramm verschoben werden. Fügen Sie die Werte in eine Tabellenkalkulation ein. Abbildung 10. Die Ausgabe von der Auswahl von Peaks im Profilplot und der Markierung der Peaks. In diesem Fall sind die Ergebnisse von der Auswahl der oberen Band in jeder der 4 Bahnen in der Beispiel Western Blot aus Abbildung 1. Hinweis: Wenn Sie versehentlich klicken Sie an der falschen Stelle mit dem Zauberstab. Das Programm zeichnet den angeklickten Bereich immer noch als Peak auf und wird in die Gesamtfläche einfließen, die zur Berechnung der Prozentwerte verwendet wird. Offensichtlich wird dies schneiden Sie Ihre Ergebnisse, wenn Sie in Bereichen, die aren8217t Gipfel klicken. Wenn du zufällig an der falschen Stelle klickst, geh einfach zu AnalyzegtGelgtLabel Peaks, um die aktuellen Ergebnisse zu zeichnen, die die falschen Werte anzeigen, aber noch wichtiger den Zähler für das Ergebnisfenster zurücksetzt. Gehen Sie zurück zum Profil-Plot und beginnen Sie, in die Gipfel wieder zu klicken, beginnend mit dem 1. Peak von Interesse. Das Ergebnisfenster sollte klar und beginnen, Ihre neuen Werte anzuzeigen. Wenn du dich in alle korrekten Gipfeln einklickst, ohne versehentlich in irgendwelche falschen Gebiete zu klicken, kannst du zurück zu AnalyzegtGelsgtLabel Peaks und bekommst die richtigen Ergebnisse. Datenanalyse Mit den Daten, die in eine Tabellenkalkulation eingefügt wurden, können Sie nun die relative Dichte der Peaks berechnen. Als Erinnerung sind die von ImageJ berechneten Werte im Wesentlichen willkürliche Zahlen, sie haben nur eine Bedeutung im Kontext des Satzes von Peaks, die du auf dem einzelnen Gelbild ausgewählt hast, an dem du gearbeitet hast. Sie haben keine Einheiten von g Protein oder irgendwelche anderen realen Einheiten, die Sie sich vorstellen können. Das normale Verfahren besteht darin, die Dichte der ausgewählten Bänder gegenüber einem Standardband auszudrücken, das Sie auch während dieses Prozesses ausgewählt haben. 1. Legen Sie Ihre Daten in eine Kalkulationstabelle. Einer der Gipfel sollte dein Standard sein. In diesem Beispiel verwenden wir den 1. Gipfel als Standard. 2. Teilen Sie in einer neuen Spalte neben der Percent-Spalte den Prozentwert für jede Probe mit dem Prozentwert für den Standard (der 1. Peak in diesem Fall 26.666). 3. Die resultierende Spalte von Werten ist ein Maß für die relative Dichte jedes Peaks, verglichen mit dem Standard, der offensichtlich eine relative Dichte von 1 aufweist. Abbildung 11. Berechnen der relativen Dichte für jeden der 4 hervorgehobenen Peaks. Wir verwenden Probe 1 als Standard für dieses Gel. Die relative Dichte wird berechnet, indem der Prozentwert für jede Probe durch den Prozentwert für den Standard dividiert wird. 4. In diesem Beispiel hat die 2. Spur eine höhere Relative Dichte (1.86), die gut mit der Größe und Dunkelheit dieser Bande im Originalbild übereinstimmt (Abbildung 1). Erinnern Sie sich, dass diese Daten für die obere Reihe von Bändern auf dem ursprünglichen Western-Blot-Bild sind. 5. Wenn Sie die Dichte der Proben auf mehreren Gelen oder Blots vergleichen möchten, müssen Sie die gleiche Standardprobe auf jedem Gel verwenden, um eine gemeinsame Referenz zu liefern, wenn Sie Relative Density Werte berechnen. Weitere Informationen finden Sie in den folgenden Abschnitten. 6. Um auf signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungen in einem Experiment zu testen, müssen alle Ihre Gele oder Blots mit dieser Methode gescannt und quantifiziert werden, und die Werte werden in Bezug auf Relative Dichte ausgedrückt, oder Sie können Relative Dichte behandeln Als ein Fold-Change-Wert (dh eine Relative Density-Differenz von 2 zwischen einer Kontrolle und einer Behandlung würde eine zweifache Änderung in der Expression anzeigen). Wenn Sie die Analyse von Varianztechniken verwenden, um Ihre Daten zu testen, müssen Sie möglicherweise sicherstellen, dass Ihre relativen Dichtewerte normal verteilt sind und dass es eine Homogenität der Abweichung zwischen den verschiedenen Behandlungen gibt. 7. Es ist anzumerken, dass einige Forscher den zusätzlichen Aufwand machen, um einen Satz von seriellen Verdünnungen eines bekannten Standards auf jedem Blot einzuschließen. Unter Verwendung der seriellen Verdünnungskurve und der oben beschriebenen Quantifizierungstechniken sollte es möglich sein, Ihre Probenbänder in Form von Pikogrammen oder Nanogrammen von Protein auszudrücken. Ein ähnlicher Beispiel mit Ladekontrollen. Wir verwenden Abbildung 12 als repräsentativen Western-Blot. Auf diesem Blot werden wir vorgeben, dass wir vier replizierte Proben von Protein (vier Pipettenlasten aus der gleichen Phiole des Homogenats) geladen haben. Daher erwarten wir, dass die Dichten in jeder Spur gleichwertig sind. Die obere Reihe der Stäbe repräsentiert unser Protein von Interesse. Der untere Satz von Stäben repräsentiert unser Ladungs-Kontroll-Protein, das dazu bestimmt ist, sicherzustellen, dass eine gleiche Menge an Gesamtprotein in jede Spur geladen wurde. Dieses Ladungs-Kontroll-Protein ist ein Protein, das vermutlich auf einem konstanten Niveau ausgedrückt wird, unabhängig von der Behandlung, die auf die ursprünglichen Organismen angewendet wird, wie zB Actin (obwohl viele Menschen die Behauptung in Frage stellen, dass Actin äquivalent über Behandlungen ausgedrückt wird). Abbildung 12. Ein Beispiel Western-Blot mit einer unteren Reihe von Ladekontrollbändern. Oft werden diese Banden ein Protein darstellen, von dem angenommen wird, dass es in allen Behandlungen, wie Actin, äquivalent ausgedrückt wird. Mit Blick auf Fig. 12 hatten wir gehofft, äquivalente Mengen an Gesamtprotein in jeder Spur zu laden, aber nach dem Wischen des Western-Blots variiert die Größe und Intensität der unteren Balken in jeder Spur sehr viel. Die beiden linken Bahnen erscheinen äquivalent, aber die dritte Spur hat die Hälfte der Dichte (Grauwert) im Vergleich zu den Spuren 12, während die Spur 4 die Hälfte der Dichte und die Hälfte der Größe im Vergleich zu den Spuren 12 hat. Weil unsere Laststeuerungen so unterschiedlich sind, ist die Dichte Werte des oberen Satzes von Bändern sind möglicherweise nicht direkt vergleichbar. Wir verwenden die Bildanalyse von ImageJ8217s, um die Dichte und die Größe der Blots zu quantifizieren und die Ergebnisse aus unseren Ladesteuerungen (untere Banden) zu verwenden, um die Werte für unser Protein von Interesse (obere Banden) zu skalieren. 1. Öffnen Sie das Western-Blot-Bild in ImageJ. 2. Vergewissern Sie sich, dass sich das Bild im 8-Bit-Modus befindet: Gehen Sie zu ImagegtTypegt8-Bit. 3. Drücken Sie 822018221 (oder Befehl 1 auf Mac), um das Rechteck einzustellen. In der Mitte des Rechtecks ​​sollte ein 822018221 angezeigt werden, indem Sie das Rechteck-Werkzeug verwenden, um einen Kasten um die gesamte 1. Spur zu zeichnen. 5. Drücken Sie 822028221 (Befehl 2 auf Mac), um das Rechteck für die Spur 2 einzustellen. Ein 822028221 sollte in der Mitte des Rechtecks ​​erscheinen. Wiederholen Sie die Schritte 5, 6 für jede nachfolgende Spur, indem Sie 822028221 (Befehl 2 auf Mac) drücken, um das Rechteck über jede nachfolgende Spur zu setzen (siehe Abbildung 13). Abbildung 13. Jede Spur wurde ausgewählt, indem man das Rechteck darüber bewegt und 822028221 einlegt Das Rechteck an Ort und Stelle 8. Wenn du die letzte Spur gelegt hast (und 822028221 gedrückt hast, um sie einzustellen), kannst du 822038221 drücken, um eine Kurve der ausgewählten Bahnen zu erzeugen (siehe Abbildung 14) Spur (angeordnet mit Spur 1 an der Spitze, Spur 4 unten). Möglicherweise müssen Sie durch das Fenster blättern, um alle Spuren zu sehen. 9. Die Profilkurve stellt im wesentlichen den mittleren Dichtewert über einen Satz von horizontalen Scheiben jeder Spur dar. Dunkler Blots haben höhere Gipfel, und Blots, die einen größeren Größenbereich (kD) abdecken, haben breitere Spitzen. In unserem Beispiel Western-Blot sind die Bands perfekte Rechtecke, aber Sie werden etwas Neigung in den Profil-Plot-Peaks bemerken, da ImageJ ein bisschen Mittelwert von Dichtewerten anwendet, während es sich von oben nach unten von jeder Spur bewegt. Infolgedessen wird der scharfe Übergang von vollkommenem Weiß zu vollkommenem Schwarz auf den Bändern der Spur 1 in eine leichte Steigung auf dem Profildiagramm aufgrund der Mittelung übersetzt. 10. Auf unserem idealisierten Western-Blot, der hier benutzt wird, gibt es kein Hintergrundgeräusch, so dass der Gipfel den ganzen Weg bis zur Grundlinie des Profil-Plots erreicht. In echten Western-Blots wird es etwas Hintergrundgeräusche geben (der Hintergrund wird nicht ganz weiß), so dass die Gipfel die Grundlinie des Profil-Plots erreichen (siehe Abbildung 5 oben). Infolgedessen muss jede Handlung eine Linie haben, die über die Basis des Gipfels gezogen wird, um sie zu schließen. 11. Wählen Sie aus der ImageJ-Symbolleiste das Selektions-Auswahlwerkzeug aus. Für jeden Peak, den du im Profil-Plot analysieren willst, zeichne eine Linie über die Basis des Peaks, um den Peak zu umschließen (Abbildung 7). Dieser Schritt erfordert einige subjektive Beurteilung auf Ihrem Teil zu entscheiden, wo die Spitze endet und das Hintergrundgeräusch beginnt. 12. Wenn jeder Peak von Interesse mit dem geradlinigen Werkzeug geschlossen ist, wechseln Sie zum Zauberstab. Wir werden das Zauberstab-Werkzeug verwenden, um jede interessante Spitze hervorzuheben, damit Image-J seine relative Flächendichte berechnen kann. 13. Wir beginnen mit der Hervorhebung der Ladekontrollbänder (untere Reihe) auf unserem Beispiel Western-Blot. Beginnend an der Spitze des Profil-Plots, verwenden Sie den Zauberstab, um in den ersten Peak zu klicken (Abbildung 15). Die Spitze sollte hervorgehoben werden, nachdem Sie darauf geklickt haben. Fahren Sie mit dem Klick auf die Ladesteuerung für die anderen Fahrspuren. Wenn eine Spur an der Unterseite des Profil-Plots nicht sichtbar ist, halten Sie die Leertaste gedrückt und klicken und ziehen Sie das Profil-Plot nach oben, um die verbleibenden Bahnen zu zeigen. Abbildung 15. Klicken Sie mit dem Zauberstab in den Ladekontrollpeak. Click on each of the loading-control peaks for the remaining lanes (ignore the protein lanes to the left for now). 14. When the loading control peak for each lane has been highlighted with the wand, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks. Each highlighted peak will be labeled with its relative size expressed as a percentage of the total area of all the highlighted peaks. You can go to the Results window and choose EditgtCopy All to copy the results for placement in a spreadsheet. Figure 16. Area and Percent values for our loading-control bands from the example western blot. Lanes 1 and 2 are equal, as we expect by looking at the original bands on the western blot (Figure 12). 15. Repeat steps 13 14 for the real sample peaks now. We are selecting these peaks separately from the loading-control peaks so that those areas are not factored into the calculation of the density of our proteins-of-interest. As before, use the Wand tool to click inside the area of the peak in the 1st lane, then continue clicking inside the peaks of the remaining lanes. When finished, go to AnalyzegtGelgtLabel Peaks to show the results. Copy the results to a spreadsheet alongside the data for the loading-control bands (Figure 17). Figure 17. Results from the loading-control bands (labeled 8220stds8221 here) and the sample protein peaks (the upper row of bands on the original western blot). Data Analysis with loading-control bands 1. With all of the relative density values now in the spreadsheet, we can calculate the relative amounts of protein on the western blot. Remember that the 8220Area8221 and 8220Percent8221 values returned by ImageJ are expressed as relative values, based only on the peaks that you highlighted on the gel. Start the analysis by calculating Relative Density values for each of the loading-standard bands. In this case, we8217ll pretend that Lane 1 is our control that we want to compare the other 3 lanes to. Divide the Percent value for each lane by the Percent value in the control (Lane 1 here) to get a set of density values that is relative to the amount of protein in Lane 18217s loading-control band (Figure 18). Figure 18. Calculate Relative Density values by dividing the Percent values in each row by the control sample8217s Percent value (Lane 1, 40.828, in our example). 2. Next we8217ll calculate the Relative Density values for our sample protein bands (upper row on the example western blot). We carry out a similar calculation as step 1, dividing the Percent value in each row by the Percent value of our control8217s protein band (Lane 1 here). Figure 19. Calculate Relative Density values for the Samples as well, using the Percent value for your control protein band (Lane 1, 40.585 here). Note: Recall that because some of our loading-control bands were wildly different on the original western blot, we can8217t simply use the Relative Density values from our Samples calculated in Step 2 as the final results. Now it is necessary to scale the Relative Density values for the Samples by the Relative Density of the corresponding loading-control bands for each lane. We do this based on the assumption that the proportional differences in the Relative Densities of the loading-control bands represent the proportional differences in amounts of total protein we loaded on the gel. In our example western blot, we have evidence of massively different amounts of total protein in each sample (poor pipetting practice, probably). 3. The final step is to scale our Sample Relative Densities using the Relative Densities of the loading-controls. On the spreadsheet, divide the Sample Relative Density of each lane by the loading-control Relative Density for that same lane. Figure 20. Adjusted Density values (yellow cells) for our samples were calculated by dividing the Relative Density of each Sample lane by the Relative Density of the loading-control for the same lane. For example, the Relative Density for Sample 4 (0.1628) was divided by the Relative Density for the loading-control in Lane 4 (0.154379) to get an Adjusted Density value of 1.054. 4. When we created our imaginary example western blot, we expected to get equivalent amounts of the protein of interest in each lane, because we (hypothetically) loaded equivalent sample volumes of protein from the same vial of homogenate in each lane. During the loading process, something went awry, and we got very different densities on the western blot. But after carrying out the loading-control corrections above, we find that our Adjusted Densities for each of the 4 lanes are roughly equivalent (all are approximately 1), indicating that there are equivalent ratios of the protein of interest contained within the sample of total protein in each lane, as we would expect. The example above represents a special case. In reality, you will typically be skilled enough to pipette equivalent amounts of total protein into your gel lanes, presumably because you have used a process like the BCA Protein Assay to quantify the total amount of protein present in each of your homogenate samples. This can obviate the need for the loading-control bands and the associated controversy about whether the protein you8217re using to assess equal loading is truly expressed consistently across all treatment levels. Extending the example to multiple western blots If you can apply equal amounts of total protein to each lane of a gel, then you only need to concern yourself with having an appropriate standard sample placed on each western blot you run for the project. For example, you might purchase an aliquot of purified Human Hsp70 and place 1l in a lane on each gel you run when probing for Hsp70. Or you might save some money by creating your own standard sample by mixing aliquots of several of your homogenates to make a large quantity of mixed homogenate that you can use to load a standard volume onto a single lane of each gel for your entire project (running out of this mixture part way through your project would be a Bad Thing). In this case you may not know the true concentration of the protein of interest in your mixed homogenate, but you will at least be able to get an equivalent amount of total protein (including the protein of interest) on each gel. The goal of the standard sample is to account for variations in antibody binding efficiency (for example if you8217re re-using a mixture of antibody on multiple western blots to save money), for variations in blocking and washing efficiency, for variation in the decay rate of a chemiluminescent reagent used to visualize the antibodies, or for variation in the exposure time of your x-ray film. In any of these cases, the intensity of the signal you get out of your western blot can vary from blot to blot (Figure 21). You can use a standard sample on each gel to normalize every other band on that same blot, and then compare across multiple blots because every band in your dataset is normalized to the same standard (be it 10ng of Human Hsp70 or a mixture of several homogenates). Figure 21. Two example western blots with a common standard sample (Lane 1). The bindingincubationdevelopment steps of these two blots varied slightly, resulting in a different final exposure which alters the absolute densities on the two blots. Because we have a standard sample on both blots, which is an identical volume of an identical protein sample (i. e. drawn from a common aliquot of homogenate), we can express the densities of the other lanes on each gel relative to the standard sample, eliminating the effects of the differing exposures. Finally, if you are using a loading-control protein band (lower row on these blots) on each gel, and a standard protein sample on multiple gels, you can correct both for differences in total protein loaded in a lane (using the loading-control band) and for differences in exposure between gels (using the standard sample). For example, consider the two gels in Figure 21. The 1st (white) gel has minimal background noise, and there is some variation the amount of protein loaded in each lane, as revealed by the size and density of the loading control bands of the samples. The 1st lane on the left is our standard sample used on each gel. The 2nd (gray) gel has more background noise due to a different exposure time, poor washing, or any number of possible problems. Again, there are different protein quantities loaded in the 4 lanes, based on the size and density of the loading-control bands on the lower half. The 1st lane on the left is the same standard protein sample as that used on the 1st gel. We would start by analyzing the two gels separately, using the protocol in the loading-control portion of this document. 1. Calculate the relative density of the loading-control bands (lower row on this gel). Use the loading-control band for the standard in lane 1 to do this calculation. 2. Calculate the relative density of the bands for the protein band of interest (upper row on this gel). Use the protein band of interest for the standard in lane 1 to do this calculation. 3. Adjust the relative densities calculated in Step 2 using the relative densities for the loading-control bands calculated in Step 1. Simply divide the relative density from Step 2 for each lane by the corresponding relative density from Step 1. After you8217ve scaled the density of the protein of interest for each sample to the standard sample, and adjusted the relative density based on the loading-control band, you are left with an estimate of the relative density of the protein of interest in each lane on your gel (relative to the standard in lane 1). Repeat this for each separate gel. When finished, you8217ll note that because every sample lane is normalized to the standard sample in Lane 1 on that particular gel, and every gel contains the same standard sample, your cross-gel comparison is already accomplished, since every sample is now normalized to the same standard sample (Figure 22). Figure 22. Example data from two western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The 8220Adjusted Density8221 for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i. e. for sample 3, 0.1857960.188449 0.98592). After all of this work, you8217re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 36) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 14 and 25) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls8217 average value as a baseline. A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring. Figure 25. A comparison of 8220area8221 values returned by ImageJ. In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake 8220bands8221 in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value darker band). Additionally, I have included the 8220area8221 value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these 8220area8221 values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 12), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 15), the value reported by Image-J is halved. Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape. The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 13) yields an equivalent value from ImageJ. Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the 8220area8221 values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed. Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 13, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i. e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same 8220area8221 value for both of these lanes. It is worth reiterating that the 8220area8221 values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above (Figure 27), the band in column 1 returns an 8220area8221 value of 4000, while in the previous two images column 1 (Figs 25 26) had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you8217ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels. Additional references 8211 The methods outlined here are by no means canonical and there are plenty of subtleties to be considered in this sort of analysis. For more practical considerations of scanning and analyzing gel images, see the following papers: Gassmann, M. Grenacher, B. Rohde, B. and Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855. doi: Tan, H. Y. and Ng, T. W. (2008). Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Optics Communications 281, 3013-3017. doi: You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. Both comments and pings are currently closed. Tau Pathology Induces Excitatory Neuron Loss, Grid Cell Dysfunction, and Spatial Memory Deficits Reminiscent of Early Alzheimers Disease Hongjun Fu 1,4 Gustavo A. Rodriguez 1,4 Mathieu Herman 1 Sheina Emrani 1 Eden Nahmani 1 Geoffrey Barrett 1 Helen Y. Figueroa 1 Eliana Goldberg 1 S. Abid Hussaini 1,2,4 ,. Karen E. Duff 1,2,3,5 ,. 1 Taub Institute for Research on Alzheimers Disease and the Aging Brain, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 2 Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University Medical Center, New York, NY 10032, USA 3 Department of Integrative Neuroscience, New York State Psychiatric Institute, New York, NY 10032, USA Received 20 July 2016. Revised 20 October 2016. Accepted 15 December 2016. Available online 19 January 2017. Published: January 19, 2017 Highlights Tau pathology induces spatial memory deficits in old, but not young, EC-Tau mice Aged EC-Tau mice exhibit grid cell hypoactivity and reduced periodicity Excitatory, but not inhibitory, MEC neurons are vulnerable to tau pathology Altered neuronal activity correlates with neurodegeneration in old EC-Tau The earliest stages of Alzheimers disease (AD) are characterized by the formation of mature tangles in the entorhinal cortex and disorientation and confusion when navigating familiar places. The medial entorhinal cortex (MEC) contains specialized neurons called grid cells that form part of the spatial navigation system. Here we show in a transgenic mouse model expressing mutant human tau predominantly in the EC that the formation of mature tangles in old mice was associated with excitatory cell loss and deficits in grid cell function, including destabilized grid fields and reduced firing rates, as well as altered network activity. Overt tau pathology in the aged mice was accompanied by spatial memory deficits. Therefore, tau pathology initiated in the entorhinal cortex could lead to deficits in grid cell firing and underlie the deterioration of spatial cognition seen in human AD. tau pathology Alzheimers disease entorhinal cortex grid cells neuronal loss cognitive deficits neurofibrillary tangles spatial memory electrophysiology hypoactivity Figure 1. Figure 2. Figure 3. Figure 4.